枳殼為蕓香科柑橘屬植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培變種的干燥未成熟果實，性微寒，味苦、辛、酸，歸脾、胃經(jīng)；具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1]，其主產(chǎn)于江西、四川、湖南、湖北、貴州等地[2]，以江西枳殼的質(zhì)量為最佳，是江西省四大“道地藥材”之一[3]。枳殼的化學成分主要有黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類、生物堿類、多糖、三萜和其他微量成分[4-5]。枳殼的炮制方法有麩炒、酒炒、醋炒、蜜水炒等，目前《中國藥典》2020年版只收載枳殼、麩炒枳殼。枳殼生用辛燥作用較強，偏于行氣寬中除脹；經(jīng)麩炒后可緩和其峻烈之性，偏于理氣健胃消食。枳殼經(jīng)麩炒后，臨床應(yīng)用發(fā)生了改變，可見，對中藥飲片不同炮制品的準確區(qū)分對臨床科學合理用藥至關(guān)重要[6]。
        氣味是傳統(tǒng)中藥經(jīng)驗鑒別的重要特征之一，枳殼經(jīng)麩炒后，氣味由“清香”轉(zhuǎn)向“略有焦香氣”，但此描述較為主觀、模糊。隨著仿生技術(shù)的不斷發(fā)展，電子鼻技術(shù)已廣泛應(yīng)用于食品[7-8]、農(nóng)業(yè)[9]、醫(yī)藥[10-12]、環(huán)境科學[13]等領(lǐng)域。Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)基于頂空氣相原理，具有使用壽命長、信號穩(wěn)定、重復(fù)性好、分析時間短等優(yōu)點[6]。
        本研究基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻技術(shù)結(jié)合Arochembase數(shù)據(jù)庫比對分析，采用氣味指紋圖譜、多變量統(tǒng)計分析方法對枳殼麩炒前后氣味差異標志物進行快速識別，以期從氣味上快速鑒別生、麩炒枳殼飲片，為生、麩炒枳殼飲片的質(zhì)量控制提供參考。
       1 儀器與材料
       1.1 儀器
        Heracles NEO型超快速氣相電子鼻、PAL RSI型全自動頂空進樣器、MXT-5非極性毛細管柱、MXT-1701中極性毛細管柱，法國Alpha MOS公司；GA-380N型低噪音空氣泵，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；GH-380N型高純氫氣發(fā)生器，北京中興匯利科技發(fā)展有限公司；FA1104N型電子分析天平，上海菁海儀器有限公司；BO-400Y型多功能粉碎機，中國永康鉑歐五金廠。
       1.2 材料
        12批枳殼樣品購于甘肅中天藥業(yè)有限責任公司，具體樣品批次信息見表1，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學藥學院陳建偉教授鑒定，確定樣品來源為蕓香科植物酸橙C. aurantium L.的干燥未成熟果實。         正構(gòu)烷烴nC6～nC16混合對照品，美國Restek公司，批號A10142930；α-蒎烯對照品，批號110897-202204，質(zhì)量分數(shù)98.4%，購自中國食品藥品檢驗研究院；D-檸檬烯對照品（CAS號7705-14-8，質(zhì)量分數(shù)95%）、β-月桂烯對照品（CAS號123-35-3，質(zhì)量分數(shù)≥90%）購自上海源葉生物科技有限公司。
        2 方法與結(jié)果
        2.1 生、麩炒枳殼的炮制
        將12批枳殼藥材，按照《中國藥典》2020年版一部枳殼項下收載的枳殼、麩炒枳殼飲片炮制方法，分別對應(yīng)炮制成生枳殼飲片12批（編號R1～R12）、麩炒枳殼飲片12批（編號F1～F12），供實驗研究用。
        2.2 對照品溶液的制備
        分別精密量取D-檸檬烯對照品、α-蒎烯對照品、β-月桂烯對照品各1 μL，置20 mL頂空進樣瓶中，分別精密加入20 μL正構(gòu)烷烴nC6～nC16混合標準品溶液，密封，即得對照品溶液。
        2.3 供試品溶液的制備
        取各批次生、麩炒枳殼樣品，經(jīng)打粉后過二號篩，密封冷藏備用。分析時，稱取樣品粉末1.0 g至20 mL頂空瓶中，以鋁制硅膠墊的頂空瓶蓋進行鉗口密封，備用。
        2.4 生、麩炒枳殼氣味檢測方法的建立
        為獲得良好的分離分析效果，需要對檢測條件進行優(yōu)化，尋找最佳檢測條件。選取編號為F12供試品粉末作為樣品，對孵化溫度、孵化時間、樣品用量、進樣量等關(guān)鍵影響因素進行單因素考察。
        2.4.1 孵化溫度考察 精密稱定F12樣品0.5 g，在孵化時間20 min，進樣量3000 μL的條件下，考察孵化溫度60、65、70、75、80 ℃，每個水平平行測定3次。對所得色譜圖信息進行分析，發(fā)現(xiàn)在75 ℃時，所得色譜峰的信息較豐富，且各色譜峰峰形良好、穩(wěn)定。因此，選擇孵化溫度為75 ℃。在孵化溫度從60 ℃升至80 ℃的過程中，50～60 s處色譜峰增高較為明顯，孵化溫度為75 ℃時，平均增幅高于20%。
       2.4.2 孵化時間考察 精密稱定F12樣品0.5 g，在孵化溫度75 ℃，進樣量3000 μL的條件下，考察孵化時間5、10、15、20、25 min，每個水平平行測定3次。對所得色譜圖信息進行分析，發(fā)現(xiàn)隨著孵化時間的延長，色譜峰的峰面積逐漸增大。當孵化時間達到10 min時，各色譜峰趨于飽和穩(wěn)定，因此選擇孵化時間為10 min。在孵化時間從5 min增加到25 min的過程中，當孵化時間為10 min及更長時，在50～60 s處色譜峰峰面積增幅均高達500%。
        2.4.3 樣品用量考察 在孵化溫度75 ℃，孵化時間10 min，進樣量3000 μL的條件下，考察樣品用量0.7、0.8、0.9、1.0、1.1 g，每個水平平行測定3次。結(jié)果分析表明，當樣品用量為1.0 g時，所得色譜圖信息良好，因此，選擇樣品用量為1.0 g。
        2.4.4 進樣量考察 精密稱定F12樣品1.0 g，在孵化溫度75 ℃，孵化時間10 min的條件下，考察進樣量1000、2000、3000、4000、5000 μL，每個水平平行測定3次。對所得色譜圖信息進行分析，發(fā)現(xiàn)當進樣量達到4000 μL后，色譜峰穩(wěn)定，表明其氣味基本趨于飽和，因此，選擇進樣量為4000 μL。
        2.4.5 檢測條件的確定 通過單因素實驗的考察，確定生、麩炒枳殼的Heracles NEO檢測條件為：樣品瓶20 mL；稱樣量1.0 g；孵化溫度75 ℃，孵化時間10 min，孵化爐轉(zhuǎn)速500 r/min，捕集阱初始溫度40 ℃，捕集阱最終溫度250 ℃，捕集阱分流速率10 mL/min，捕集持續(xù)時間26 s，進樣口溫度200 ℃，檢測器溫度260 ℃；進樣量4000 μL，進樣體積流量125 μL/s，進樣持續(xù)時間21 s，柱溫的初始溫度50 ℃，柱溫程序升溫方式4.0 ℃/s至90 ℃、1.0 ℃/s至160 ℃、0.2 ℃/s至165 ℃，保持5 s、2.0 ℃/s至225 ℃、4.0 ℃/s至250 ℃，保持30 s；采集時間150 s；FID增益12。
        2.5 方法學考察
        2.5.1 精密度試驗 按“2.3”項下方法制備1批供試品粉末，分別裝于6個電子鼻專用頂空進樣瓶中，每份稱取1.0 g，精密稱定，用隔墊密封，放置在自動進樣器上，進樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個色譜峰的保留時間和峰面積的RSD最大值分別為0.38%、4.4%，表明儀器精密度良好。         2.5.2 重復(fù)性試驗 按“2.3”項下方法平行制備6批供試品粉末，裝于6個進樣瓶中，每份稱取1.0 g，精密稱定，進樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個色譜峰的保留時間和峰面積的RSD最大值分別為0.35%、4.7%，表明方法重復(fù)性較好。
       2.5.3 穩(wěn)定性試驗 按“2.3”項下方法制備1批供試品粉末，分別于0、2、4、8、12、24 h進樣分析。結(jié)果（表2）表明，11個色譜峰的保留時間和峰面積的RSD最大值分別為0.44%、4.9%，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。
       2.6 超快速氣相電子鼻檢測結(jié)果分析
       按“2.4.5”項下的檢測條件對生、麩炒枳殼飲片各批次樣品進行分析，建立氣味指紋圖譜。將校正混合物正構(gòu)烷烴nC6～nC16及對照品置頂空瓶中，以與樣品相同的孵育和分析條件進行分析，將生、麩炒枳殼飲片色譜峰的保留時間轉(zhuǎn)化為Kovats保留指數(shù)，參照AroChembase數(shù)據(jù)庫對樣品中的揮發(fā)性成分進行定性分析[6,14]，比較生、麩炒枳殼飲片氣味成分變化。以Alpha Soft 17.0（法國Toulouse公司）軟件對各樣品氣味指紋圖譜進行多元統(tǒng)計分析，比較各樣品差異，尋找差異性氣味標志化合物。
      2.6.1 氣味指紋圖譜的建立 基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻檢測分析結(jié)果，以MXT-5色譜柱采集的信號建立生、麩炒枳殼飲片樣品氣味指紋圖譜，結(jié)果如圖1、2所示。        將生枳殼飲片和麩炒枳殼飲片氣味指紋圖譜共有模式（由于色譜峰主要集中在前90 s內(nèi)，故選擇前90 s的色譜圖）作鏡像圖，比較兩者色譜峰的數(shù)目及峰面積變化規(guī)律，尋找專屬性差異，可直觀觀察炮制前后的氣味量比關(guān)系變化情況，結(jié)果見圖3。由圖譜可知，在前10～30 s內(nèi)，麩炒枳殼相比于生枳殼，色譜峰數(shù)目有增加，例如4、6號峰；在50～70 s內(nèi)，麩炒枳殼相比于生枳殼，色譜峰數(shù)目幾乎無變化，但色譜峰的峰高下降明顯，例如8～10號峰；經(jīng)計算發(fā)現(xiàn)，12批麩炒枳殼飲片中8號峰（β-月桂烯）峰高平均下降54.5%、9號峰（D-檸檬烯）平均下降42.4%，10號峰（γ-松油烯）平均下降46.1%，表明枳殼經(jīng)麩炒后揮發(fā)性成分含量下降明顯。與文獻“經(jīng)麩炒后，麥麩皮可以吸收部分揮發(fā)油，使揮發(fā)油成分降低”論述相一致[15]。        2.6.2 主成分分析（principal component analysis，PCA） PCA是一種無監(jiān)督的模式識別方法，將數(shù)據(jù)降維處理提取幾個特征值較大且能反映樣本信息變量的因子進行線性分類，可在多維空間直觀顯示樣品間的差異，同時也可顯示變量之間的分布[11,16]。將超快速氣相電子鼻所分離色譜峰作為影響因子，進行PCA，結(jié)果見圖4。在PCA模型中，第1主成分（PC1）貢獻率為99.504%，第2主成分（PC2）貢獻率為0.196%，第3主成分（PC3）貢獻率為0.185 7%，主成分累積貢獻率之和達99.885 7%，能較好地對生、麩炒枳殼飲片進行區(qū)分。         2.6.3 判別因子分析（discriminant factor analysis，DFA） DFA是在主成分分析的基礎(chǔ)上，根據(jù)某些準則建立判別函數(shù)，將不同組別樣本的差異擴大，使同類樣本間差異縮小的一種具有判別分類功能的數(shù)據(jù)模型，可以用來識別和分類未知樣本[11,17]。對生、麩炒枳殼樣品的超快速氣相電子鼻數(shù)據(jù)進行判別因子分析，結(jié)果如圖5所示，橫、縱坐標分別表示DFA轉(zhuǎn)換得到的第1區(qū)分指數(shù)（DF1）和第2區(qū)分指數(shù)（DF2）。圖中DF1的區(qū)分指數(shù)為100%，說明DFA分析法能夠更好地從氣味角度區(qū)分生、麩炒枳殼樣品，且二者距離較遠，氣味明顯改變，差異較大，這也符合實際感官描述。表明氣相電子鼻可以快速鑒別生、麩炒枳殼飲片，進一步驗證了PCA的分析結(jié)果。        2.6.4 生、麩炒枳殼飲片氣味差異標志物分析 將生、麩炒枳殼飲片在超快速氣相電子鼻色譜柱上采集到的色譜峰與Arochembase數(shù)據(jù)庫進行匹配分析，結(jié)果共鑒定出11個主要氣味化學成分，其中生枳殼飲片中有9個氣味化學成分，與麩炒枳殼相比，缺少甲基叔丁基醚、異戊醇2個成分。生、麩炒枳殼中可能存在的化合物及感官描述信息見表3。進一步分析已鑒定出的可能化合物氣味信息發(fā)現(xiàn)，β-月桂烯、D-檸檬烯、γ-松油烯、4-異丙烯基甲苯、2-壬基醇具有“桔子、橙、檸檬”的味道，而桔子、橙、檸檬均為蕓香科柑橘屬植物，果皮均含有豐富的揮發(fā)油，β-月桂烯、D-檸檬烯和γ-松油烯為單萜類化合物，是揮發(fā)油的組成成分，具有特殊香氣，且D-檸檬烯主要存在于柑橘類植物中[18]；本研究用枳殼飲片來源于蕓香科柑橘屬植物，表明已鑒定出的成分與枳殼含有的成分有較好的一致性。       在得到生、麩炒枳殼飲片氣味成分信息的基礎(chǔ)上，為進一步分析得出氣味差異標志物，以11個氣味成分所對應(yīng)的色譜峰峰面積為變量，采用SIMCA 14.1軟件建立生、麩炒枳殼OPLS-DA模型，分析得到11個成分的VIP值，結(jié)果見圖6。VIP值越大，表明該成分對區(qū)分生、麩炒枳殼飲片的貢獻越大。由圖6可知，對區(qū)分生、麩炒枳殼飲片貢獻較大的前3個成分是D-檸檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯，且這3個成分也是多數(shù)學者研究[19-20]有報道的枳殼揮發(fā)油組成成分，結(jié)合枳殼麩炒前后揮發(fā)性成分含量變化情況，初步推測這3個成分為區(qū)分生、麩炒枳殼飲片的氣味差異標志物。        3 討論
       中藥飲片經(jīng)炮制后，其色、氣、味多會發(fā)生改變，真?zhèn)蝺?yōu)劣的判斷多依靠老藥工的經(jīng)驗來判斷，具有主觀性強、傳承難度大的缺點[21]。隨著科學技術(shù)的發(fā)展，目前電子眼、電子鼻、電子舌等新型仿生感官技術(shù)已逐步應(yīng)用于中藥飲片質(zhì)量控制方面，將傳統(tǒng)經(jīng)驗鑒別進行了客觀化表達。
       枳殼為蕓香科柑橘屬植物的未成熟果實，眾所周知，蕓香科柑橘屬植物所結(jié)果實的果皮中含有揮發(fā)油，大多數(shù)具有清香的氣味，且枳殼經(jīng)麩炒后氣味發(fā)生變化，轉(zhuǎn)變?yōu)?ldquo;略有焦香氣”。本研究基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻建立了生、麩炒枳殼飲片氣味快速檢測方法，測定了生、麩炒枳殼飲片氣味指紋圖譜，指認了11個氣味化學成分，其中甲基叔丁基醚和異戊醇為麩炒枳殼飲片中新增加成分；結(jié)合OPLS-DA模型中的VIP值及成分變化情況，推測D-檸檬烯、β-月桂烯和γ-松油烯為生、麩炒枳殼氣味差異標志物。
       枳殼經(jīng)麩炒后，其燥性得到緩和，偏于理氣健胃消食，生熟異治，更好地滿足臨床治療需求。揮發(fā)油是枳殼“寬中除脹”的主要活性成分，枳殼經(jīng)麩炒后，對胃腸道的刺激作用減弱，其含有的成分對胃排空、腸蠕動具有明顯的促進作用，能抑制胃腸平滑肌收縮[22-23]，還具有抗炎、抑菌、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用[20,24-27]。有學者研究發(fā)現(xiàn)麩炒的過程中輔料麥麩能與共炒的飲片發(fā)生化學變化[28]，存在相互吸附作用[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，枳殼經(jīng)麩炒后有成分的新增，已初步鑒定出的甲基叔丁基醚和異戊醇推測可能是麥麩與枳殼在高溫炒制過程中發(fā)生復(fù)雜的化學反應(yīng)產(chǎn)生的新成分，也有可能是麥麩中的揮發(fā)性成分吸附至枳殼。枳殼和麥麩在炒制過程中揮發(fā)性成分的組成及含量變化是麩炒枳殼性味及功效發(fā)生變化的基礎(chǔ)，還需要進一步深入研究麩炒過程中成分變化的規(guī)律，同時結(jié)合藥效學研究，闡明研究麩炒枳殼的炮制機理。
       與傳統(tǒng)GC-MS聯(lián)用技術(shù)方法相比，超快速氣相電子鼻采用雙色譜柱同時進樣分析，通過Kovats保留指數(shù)對氣味成分進行定性分析，具有分析時間短、靈敏度高、樣品用量少、無需對樣品進行預(yù)處理等優(yōu)點。但基于其檢測原理，儀器使用時對環(huán)境要求較高，使用過程中要保證環(huán)境的穩(wěn)定；且匹配數(shù)據(jù)庫AroChembase也具有一定局限性，國外在研發(fā)儀器時多是針對某一類物質(zhì)如烴類、醇類[30]，定性分析出來的氣味成分專屬性、特征性較弱，難以滿足氣味復(fù)雜的中藥的需求。但超快速電子鼻作為新興現(xiàn)代仿生技術(shù)，可實現(xiàn)中藥飲片的快速檢測，有望應(yīng)用于中藥飲片生產(chǎn)過程的在線檢測，可極大促進中藥飲片產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。
        本研究中生、麩炒枳殼鑒別出的氣味成分數(shù)量有限，后續(xù)研究可結(jié)合GC-MS、HS-SPME-GC-MS等多種檢測手段，從定性定量角度更加全面分析枳殼麩炒前后各類成分變化情況，以期為研究枳殼麩炒機理及枳殼飲片生產(chǎn)質(zhì)量在線監(jiān)測提供參考。
       來 源：中草藥雜志社
       參考文獻：梅 茜，許金國，蘇聯(lián)麟，毛春芹，陸兔林，房 方．基于Heracles NEO超快速氣相電子鼻對枳殼麩炒前后氣味差異標志物的快速識別研究 [J]. 中草藥, 2023, 54(16):5165-5171.
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